改善熒光團(tuán)的分離，并增加您可以在樣本中區(qū)分的熒光探針數(shù)量

在顯微鏡實(shí)驗(yàn)中，通常需要同時(shí)分析樣本中的多種結(jié)構(gòu)和分子。這可以通過使用不同顏色的熒光標(biāo)記標(biāo)記每個(gè)感興趣的特征來實(shí)現(xiàn)。然而，能夠成功區(qū)分的熒光團(tuán)數(shù)量是有限的。多色共聚焦顯微鏡經(jīng)常受到樣本中熒光探針光譜重疊的限制。本文探討了熒光團(tuán)光譜分離中的常見挑戰(zhàn)以及如何克服這些挑戰(zhàn)，包括使用熒光壽命成像作為分離具有重疊光譜的熒光團(tuán)的替代方法。

在本文中，我們探討了幾種策略，您可以采取這些策略來改善熒光團(tuán)的分離，并增加您可以在樣本中區(qū)分的熒光探針數(shù)量。

介紹

多色共聚焦顯微鏡是當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的一種基本技術(shù)。為了揭示生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，需要能夠同時(shí)分析樣本中的多個(gè)結(jié)構(gòu)、分子和微環(huán)境，并將它們相互關(guān)聯(lián)。這可以通過使用不同顏色的熒光標(biāo)記或生物傳感器標(biāo)記每個(gè)感興趣的特征來實(shí)現(xiàn)，然后進(jìn)行同時(shí)或順序的多通道成像，以捕獲每個(gè)探針在特定通道中的信號。然而，這種“多重化"方法的熒光染料數(shù)量是有限的。本文將深入探討限制多色共聚焦顯微鏡多重化能力的一些挑戰(zhàn)，以及改善熒光染料分離并增加可區(qū)分熒光探針數(shù)量的一些策略。

為什么多色共聚焦實(shí)驗(yàn)如此具有挑戰(zhàn)性？

在多色共聚焦顯微鏡中，無法找到合適的熒光探針組合是一個(gè)常見的難題，這可能會顯著延緩實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。導(dǎo)致這個(gè)問題的因素包括可用于光譜分離的熒光染料或熒光蛋白（FP）的可用性，以及共聚焦系統(tǒng)的限制，例如激發(fā)線、濾光片和探測器的數(shù)量和特異性。雖然有機(jī)熒光體的激發(fā)和發(fā)射峰通常在其最大高度的一半（FWHM）處寬度約為35納米，但完整的光譜特征往往可以跨越幾百納米，包括肩部和長尾部（見圖1）。考慮到可見光譜本身僅跨越約360納米（從約380到740納米），在多色實(shí)驗(yàn)中，特別是結(jié)合超過三種熒光體的實(shí)驗(yàn)中，光譜重疊幾乎是不可避免的。光譜重疊可能導(dǎo)致嚴(yán)重的偽影，包括熒光團(tuán)之間的不必要能量轉(zhuǎn)移和一種熒光團(tuán)的發(fā)射信號滲透到另一個(gè)熒光團(tuán)的檢測通道中（也稱為光譜串?dāng)_或交叉）。此外，還可能遇到自發(fā)熒光和光毒性問題，這些問題使得在某些光譜區(qū)域激發(fā)染料變得不可行。

考慮一個(gè)四色實(shí)驗(yàn)，其中染料為 Alexa 488、Alexa 546、Alexa 568 和 TOTO-3（圖 1）。激發(fā)線必須仔細(xì)定位，以避免在每個(gè)通道中激發(fā)超過預(yù)期的染料。這可能會帶來一些權(quán)衡，例如由于偏離峰值中心而導(dǎo)致某些物種的激發(fā)效率低下。更重要的是，發(fā)射曲線的強(qiáng)光譜重疊使得避免串?dāng)_偽影成為一項(xiàng)挑戰(zhàn)。因此，很難判斷在受影響的圖像通道中，實(shí)際上是哪個(gè)熒光染料產(chǎn)生了你所看到的信號。

圖 1：Alexa 488、Alexa 546、Alexa 568 和 TOTO-3 的激發(fā)和發(fā)射光譜。

串色的后果

為了說明串色如何影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖 2（A）顯示了僅兩個(gè)熒光染料的典型激發(fā)曲線，一個(gè)綠色和一個(gè)紅色。如圖 B 所示，這兩種染料的相應(yīng)發(fā)射曲線重疊。如果樣品中兩種染料的發(fā)射水平不可比，重疊的相對比例可能會更顯著（C）。當(dāng)發(fā)射的光通過檢測器（在這個(gè)假設(shè)的情況下通過帶通濾光片）時(shí)，兩個(gè)熒光染料的信號都在紅色通道中被檢測到（D）。

像這樣的串色偽影可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)解釋中的嚴(yán)重錯(cuò)誤，特別是在研究亞細(xì)胞熒光染料的共定位或需要定量測量時(shí)。例如，當(dāng)將前面示例中的綠色和紅色通道圖像疊加時(shí)，會看起來好像這兩種染料部分共定位，而實(shí)際上它們被分隔在不同的亞細(xì)胞區(qū)室中（圖 3）。串色還可能影響依賴于強(qiáng)度測量的實(shí)驗(yàn)，例如涉及福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）或光漂白后的熒光恢復(fù)（FRAP）。

圖 2：2a：綠色通道的發(fā)射光譜 - 所有FITC發(fā)射的?進(jìn)入綠色通道，而?進(jìn)入紅色通道。2b：紅色通道的發(fā)射光譜 - 所有 TRITC 發(fā)射的 1/5 進(jìn)入綠色通道，而 4/5 進(jìn)入紅色通道。2c：雙標(biāo)記樣品的發(fā)射信號。黑色曲線表示兩個(gè)熒光團(tuán)信號的總和。

標(biāo)本標(biāo)記的考慮事項(xiàng)

在為多色共聚焦實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣本時(shí)，有許多重要的考慮事項(xiàng)和措施可以采取，以避免或減少由光譜重疊引起的偽影。

01熒光染料選擇

考慮是否可以用具有更窄發(fā)射峰和/或更大斯托克斯位移（激發(fā)和發(fā)射最大值之間的分離）的染料替代潛在問題熒光染料。例如，熒光量子點(diǎn)（QD）具有多種適合多重標(biāo)記的特性，包括相對較窄和對稱的發(fā)射曲線、光譜中均勻分布的多種顏色選擇，以及能夠使用相同激發(fā)波長同時(shí)激發(fā)多個(gè)光譜變體的能力。一些基因編碼的熒光蛋白（FP）也經(jīng)過工程改造以改善多重標(biāo)記，例如Keima和LSSmOrange，它們具有異常大的斯托克斯位移，使得與傳統(tǒng)熒光蛋白和化學(xué)染料結(jié)合時(shí)能夠進(jìn)行單次激發(fā)的多色成像。

02 發(fā)射強(qiáng)度的平衡

如果樣本中熒光團(tuán)的發(fā)射強(qiáng)度水平存在顯著差異，強(qiáng)熒光物種的信號可能會淹沒弱熒光物種的信號，從而導(dǎo)致特定通道中不成比例的串?dāng)_（見圖2）。目標(biāo)豐度、染料濃度、量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性和照明強(qiáng)度都是可能導(dǎo)致發(fā)射不平衡的因素。如果樣本中不同目標(biāo)的豐度差異很大，明智的做法是將最亮和最光穩(wěn)定的染料保留給豐度的目標(biāo)。在樣本準(zhǔn)備過程中，熒光探針的濃度應(yīng)仔細(xì)滴定。在某些情況下，這可能不可行，例如在成像表達(dá)差異調(diào)控FP物種的活細(xì)胞時(shí)。在這種情況下，可以通過使用陽性和陰性對照樣本優(yōu)化每個(gè)通道的激發(fā)強(qiáng)度，在圖像采集階段補(bǔ)償不平衡。

03 對照樣本的準(zhǔn)備

單染色對照樣本對于評估和減少在優(yōu)化圖像采集參數(shù)時(shí)的串?dāng)_至關(guān)重要。它們還提供了可以用于后續(xù)光譜解混的信息，并支持實(shí)驗(yàn)結(jié)論（例如，在發(fā)布共定位研究或定量顯微鏡方法的結(jié)果時(shí)）。對于活細(xì)胞檢測，準(zhǔn)備有刺激和無刺激的重復(fù)單染色樣本（即陽性和陰性對照）非常重要，以便評估在預(yù)期的動態(tài)范圍內(nèi)潛在的串?dāng)_和其他偽影，并相應(yīng)地調(diào)整采集設(shè)置。

圖 3：HeLa 細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）；藍(lán)色：Dapi，細(xì)胞核；綠色：Alexa 488，微管；紅色：TRITC 鬼筆環(huán)肽，肌動蛋白；灰色：Mito Tracker Red CMXRos，線粒體。

優(yōu)化圖像采集以光譜分離

一旦樣品準(zhǔn)備得到優(yōu)化，下一步至關(guān)重要的步驟是優(yōu)化采集參數(shù)。

01 儀器配置和采集設(shè)置

光學(xué)光路的最佳設(shè)置，包括激光器的選擇、激發(fā)波長、濾光組合和檢測帶寬，對于最小化光譜串?dāng)_至關(guān)重要，尤其是在同時(shí)掃描期間。可能需要對儀器設(shè)置和樣品準(zhǔn)備采取迭代方法，以找到最小化偽影和實(shí)現(xiàn)可靠檢測和定量所需的動態(tài)范圍之間的理想平衡。這在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中尤其具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)闊晒獾鞍妆磉_(dá)水平和染料濃度可能會廣泛且不可預(yù)測地變化。

02 順序成像

在進(jìn)行同時(shí)多通道成像時(shí)，可能會出現(xiàn)由于激發(fā)或發(fā)射光譜交叉而產(chǎn)生的偽影。在兩種熒光染料的激發(fā)光譜足夠分離但發(fā)射特征重疊的情況下，可以通過一次使用一個(gè)激發(fā)線的順序成像來避免串?dāng)_。由于激發(fā)和發(fā)射特征在其不對稱性上往往相互鏡像，激發(fā)光譜的交叉傾向于發(fā)生在光譜的藍(lán)端（短波長），此時(shí)峰值往往有較長的尾部，而發(fā)射光譜更可能在光譜的紅端（長波長）有延伸的重疊尾部。這意味著短波長的熒光探針更可能滲透到長波長通道中，而不是反過來。因此，獲取圖像的順序可能會有所不同。通常建議先用最長波長激發(fā)，然后依次向短波長工作。順序掃描的一個(gè)缺點(diǎn)是，對于某些應(yīng)用（例如監(jiān)測活細(xì)胞中的快速動態(tài)事件），它可能太慢。此外，順序成像無法防止在兩個(gè)或多個(gè)熒光探針被同一激光線激發(fā)的情況下出現(xiàn)串?dāng)_。

光譜拆分算法

盡管付出了最大的努力，但在實(shí)驗(yàn)的前分析步驟中，可能無法防止或充分減少排放不平衡和光譜重疊。幸運(yùn)的是，在圖像采集后，仍然可以通過分析方法光譜分辨樣品中的熒光團(tuán)。為了將每個(gè)熒光團(tuán)的信號數(shù)學(xué)上恢復(fù)到其各自的通道，解混算法通常基于線性解混或聚類分析方法。前者依賴于用戶估計(jì)的分布或使用參考光譜來計(jì)算每個(gè)成分熒光團(tuán)的分布系數(shù)。聚類分析方法提供了一個(gè)良好的替代方案。在沒有光譜信息的情況下，線性解混的替代方案。與使用參考光譜不同，主要的分布系數(shù)是通過擬合確定的。

盡管光譜解混工具非常有用，但它們在樣本中解析熒光探針的能力有兩個(gè)主要限制。第一個(gè)限制是光譜解混受到系統(tǒng)中探測器數(shù)量的限制。換句話說，您無法解混超過系統(tǒng)能夠檢測的顏色。第二個(gè)主要限制是光譜解混算法無法區(qū)分相同顏色的熒光團(tuán)，即那些具有相似發(fā)射光譜的熒光團(tuán)。

除了光譜選項(xiàng)之外的壽命成像

但是，如果有一種方法可以克服光譜成像的局限性，而無需向系統(tǒng)添加其他探測器或?qū)ふ姨娲臒晒馊玖夏兀筷P(guān)鍵在于超越光譜信息的分析，增加另一個(gè)維度的分析：熒光壽命。熒光壽命是指熒光染料在發(fā)射光子之前處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間。壽命信息與熒光強(qiáng)度信息是正交的，可以用來區(qū)分具有相似光譜但壽命不同的染料（圖4）。最近在壽命分析技術(shù)方面的進(jìn)展使得將壽命檢測能力集成到共聚焦掃描頭中成為可能，從而可以同時(shí)收集壽命和光譜信息。結(jié)果是能夠結(jié)合壽命和光譜信息，利用基于壽命的信息區(qū)分更多的熒光染料。

圖 4：通過壽命對比區(qū)分的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。

總結(jié)與結(jié)論

在多色共聚焦顯微鏡中，熒光探針的良好光譜分離對于獲得高質(zhì)量結(jié)果和在實(shí)驗(yàn)中包含更多熒光探針至關(guān)重要。在成像之前，仔細(xì)優(yōu)化樣品和儀器設(shè)置在減少不必要的光譜重疊引起的偽影方面起著重要作用。曾幾何時(shí)，圖像采集后幾乎沒有什么可以做的來改善結(jié)果，但通過光譜解混方法，現(xiàn)在可以在采集后解決重疊問題，盡管成像條件不理想。值得注意的是，在共聚焦平臺上實(shí)施壽命成像的開創(chuàng)性進(jìn)展，現(xiàn)在使得強(qiáng)大的熒光壽命能力能夠無縫集成到共聚焦顯微鏡工作流程中，為科學(xué)家提供了區(qū)分以前無法通過光譜解混區(qū)分的熒光探針的能力。

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